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2024/9/27 13:23:39

凈信研磨儀和真空離心濃縮儀助力---探討小鼠急性肺損傷機(jī)制

來源:上海凈信

題目:基于花生四烯酸代謝途徑探討炎調(diào)方治療脂多糖所致急性肺損傷的機(jī)制

作者:李鵬程,陳天陽,方榮,張安娜,吳思佳,劉偉,王倩

DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.20241016

急性肺損傷(ALI)是一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病,臨床特征表現(xiàn)為呼吸急促、呼吸困難、嚴(yán)重者可出現(xiàn)頑固性低氧血癥、急性呼吸窘迫綜合征,有較高的發(fā)病率和致死率。直至今日,仍然沒有治療急性肺損傷的特效藥,然而科學(xué)家對該疾病的研究從未停止。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院王倩博士帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)在研磨儀和真空離心濃縮儀的助力下進(jìn)行小鼠急性肺損傷機(jī)制的探究。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)

正常組小鼠6只,模型組小鼠6只(腹腔注射脂多糖LPS溶液建立小鼠 ALI 模型),給藥組:地塞米松組(2 mg·kg-1)、炎調(diào)方低劑量組(18 g·kg-1)、炎調(diào)方高劑量組(36 g·kg-1)各6只。

花生四烯酸(AA)類代謝物檢測樣品制備

?血清 AA 樣品制備

取血清 30 μL,置于 1.5 mL 離心管,加混合液(甲醇:乙腈,1:1,v/v)150 μL,蓋好蓋 子后渦旋震蕩 30 s,使蛋白質(zhì)變性沉淀,在 4 ℃,15 000 r·min-1 離心 10 min,取上清 144 μL 置于新的 1.5 mL 離心管中,真空離心濃縮儀吹干;加入混合液(水:甲醇:乙腈,2:1:1,v/v)60 μL 至吹干的離心管中,渦旋震蕩 60 s,使干燥殘?jiān)鼜?fù)溶,在 4 ℃,15 000 r·min-1 離心 10 min,取上清 50 μL 置內(nèi)襯管中,進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS/MS)分析, 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

Fig2(Nat. Plants,2024)

?肺組織AA樣品制備

準(zhǔn)確稱取肺組織 30 mg 置于 1.5 mL 離心管,加入混合液(甲醇:乙腈,1:1,v/v)600 μL, 放入 2 顆研磨珠,使用研磨儀,65 Hz,研磨 1 min,研磨2 次。

將研磨后的勻漿液在 4 ℃,15 000 r·min-1 離心 10 min,取上清 480 μL 置于新的 1.5 mL 離心管中,用真空離心濃縮儀吹干。加入混合液(水:甲醇:乙腈,2:1:1,v/v)96 μL 至吹干的 離心管中,渦旋震蕩 60 s,使干燥殘?jiān)鼜?fù)溶,在 4 ℃,15 000 r·min-1 離心 10 min,取上清 80 μL 置于內(nèi)襯管中,進(jìn) LC-MS/MS 分析,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

?色譜條件

采用 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動相 A(0.1%甲酸水)- 流動相 B(乙腈),梯度洗脫(0~10 min,48%~75%B;10~10.1 min,75%~90%B;10.1~12 min,90%B;12~12.1 min,90%~48%B;12.1~14 min,48%B);進(jìn)樣量為 3 μL,體積流量為 0.25 mL·min-1,柱溫恒定為 36 ℃,總離子流圖如下

注:A.對照品;B.血清;C.肺組織;1.PGE2;2. PGD2;3. 15-HETE;4. 11(S)-HETE;5. 5-HETE;6. 14,15-EET;7. 11,12-EET;8. 8,9- EET

圖 1 花生四烯酸類代謝物檢測總離子流色譜

通過對正常組、模型組和給藥組小鼠肺組織中花生四烯酸(AA)類代謝物對比分析,炎調(diào)方可影響 AA 在體內(nèi)的 3 條主要代謝途徑,通過降低血清和肺組織中促炎類代謝產(chǎn)物的含量,以及提高血清和肺組織中 11,12-EET 的含量而發(fā)揮廣泛的抗炎作用,從而減輕 LPS 所致 ALI。通過研磨儀研磨樣本,把目標(biāo)物質(zhì)釋放,加入試劑提取,然后用真空離心濃縮儀濃縮,濃縮后的樣本可進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析。研磨儀和真空離心濃縮儀的配合使用,使GC-MS/LC-MS分析更方便,上機(jī)檢測前處理更簡單,更快捷。

文中所用儀器

真空離心濃縮儀

真空離心濃縮儀可用于化學(xué)、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的樣品制備和分析,在生命科學(xué)領(lǐng)域中,真空離心濃縮儀常用于分離和濃縮蛋白質(zhì)、核酸和其他生物分子。真空離心濃縮是一種將溶劑蒸發(fā)出去以濃縮或干燥生物(非生物)樣品的過程。采用離心力、真空和加熱相結(jié)合的方法使樣品中的溶劑快速蒸發(fā),從而達(dá)到濃縮樣品的目的,方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分析和檢測。

高通量組織研磨儀

高通量組織研磨儀能將任何來源(包括土壤、植物和動物的組織/器官、細(xì)菌、酵母、真菌、孢子、古生物標(biāo)本等)的原始DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和純化。

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