凈信研磨儀和真空離心濃縮儀助力---探討小鼠急性肺損傷機(jī)制

題目：基于花生四烯酸代謝途徑探討炎調(diào)方治療脂多糖所致急性肺損傷的機(jī)制

作者：李鵬程，陳天陽，方榮，張安娜，吳思佳，劉偉，王倩

DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20241016

急性肺損傷（ALI）是一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，臨床特征表現(xiàn)為呼吸急促、呼吸困難、嚴(yán)重者可出現(xiàn)頑固性低氧血癥、急性呼吸窘迫綜合征，有較高的發(fā)病率和致死率。直至今日，仍然沒有治療急性肺損傷的特效藥，然而科學(xué)家對該疾病的研究從未停止。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院王倩博士帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)在研磨儀和真空離心濃縮儀的助力下進(jìn)行小鼠急性肺損傷機(jī)制的探究。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)

正常組小鼠6只，模型組小鼠6只（腹腔注射脂多糖LPS溶液建立小鼠 ALI 模型），給藥組：地塞米松組（2 mg·kg-1）、炎調(diào)方低劑量組（18 g·kg-1）、炎調(diào)方高劑量組（36 g·kg-1）各6只。

花生四烯酸（AA）類代謝物檢測樣品制備

?血清 AA 樣品制備

取血清 30 μL，置于 1.5 mL 離心管，加混合液（甲醇：乙腈，1:1，v/v）150 μL，蓋好蓋 子后渦旋震蕩 30 s，使蛋白質(zhì)變性沉淀，在 4 ℃，15 000 r·min-1 離心 10 min，取上清 144 μL 置于新的 1.5 mL 離心管中，真空離心濃縮儀吹干；加入混合液（水：甲醇：乙腈，2:1:1，v/v）60 μL 至吹干的離心管中，渦旋震蕩 60 s，使干燥殘?jiān)鼜?fù)溶，在 4 ℃，15 000 r·min-1 離心 10 min，取上清 50 μL 置內(nèi)襯管中，進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS/MS）分析， 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

Fig2（Nat. Plants，2024）

?肺組織AA樣品制備

準(zhǔn)確稱取肺組織 30 mg 置于 1.5 mL 離心管，加入混合液（甲醇：乙腈，1:1，v/v）600 μL， 放入 2 顆研磨珠，使用研磨儀，65 Hz，研磨 1 min，研磨2 次。

將研磨后的勻漿液在 4 ℃，15 000 r·min-1 離心 10 min，取上清 480 μL 置于新的 1.5 mL 離心管中，用真空離心濃縮儀吹干。加入混合液（水：甲醇：乙腈，2:1:1，v/v）96 μL 至吹干的 離心管中，渦旋震蕩 60 s，使干燥殘?jiān)鼜?fù)溶，在 4 ℃，15 000 r·min-1 離心 10 min，取上清 80 μL 置于內(nèi)襯管中，進(jìn) LC-MS/MS 分析，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

?色譜條件

采用 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相 A（0.1%甲酸水）- 流動相 B（乙腈），梯度洗脫（0~10 min，48%~75%B；10~10.1 min，75%~90%B；10.1~12 min，90%B；12~12.1 min，90%~48%B；12.1~14 min，48%B）；進(jìn)樣量為 3 μL，體積流量為 0.25 mL·min-1，柱溫恒定為 36 ℃，總離子流圖如下

注：A.對照品；B.血清；C.肺組織；1.PGE2；2. PGD2；3. 15-HETE；4. 11(S)-HETE；5. 5-HETE；6. 14,15-EET；7. 11,12-EET；8. 8,9- EET

圖 1 花生四烯酸類代謝物檢測總離子流色譜

通過對正常組、模型組和給藥組小鼠肺組織中花生四烯酸（AA）類代謝物對比分析，炎調(diào)方可影響 AA 在體內(nèi)的 3 條主要代謝途徑，通過降低血清和肺組織中促炎類代謝產(chǎn)物的含量，以及提高血清和肺組織中 11,12-EET 的含量而發(fā)揮廣泛的抗炎作用，從而減輕 LPS 所致 ALI。通過研磨儀研磨樣本，把目標(biāo)物質(zhì)釋放，加入試劑提取，然后用真空離心濃縮儀濃縮，濃縮后的樣本可進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析。研磨儀和真空離心濃縮儀的配合使用，使GC-MS/LC-MS分析更方便，上機(jī)檢測前處理更簡單，更快捷。

文中所用儀器

真空離心濃縮儀

真空離心濃縮儀可用于化學(xué)、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的樣品制備和分析，在生命科學(xué)領(lǐng)域中，真空離心濃縮儀常用于分離和濃縮蛋白質(zhì)、核酸和其他生物分子。真空離心濃縮是一種將溶劑蒸發(fā)出去以濃縮或干燥生物(非生物)樣品的過程。采用離心力、真空和加熱相結(jié)合的方法使樣品中的溶劑快速蒸發(fā)，從而達(dá)到濃縮樣品的目的，方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分析和檢測。

高通量組織研磨儀

高通量組織研磨儀能將任何來源(包括土壤、植物和動物的組織/器官、細(xì)菌、酵母、真菌、孢子、古生物標(biāo)本等)的原始DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和純化。

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